基因型  

Ach5(rifR)TipAL4404(strepR)Octopine  

產品說明  

LBA4404菌株為Ach5型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的章魚堿型Ti質粒pAL4404，此質粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pAL4404質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移）。pAL4404型Ti質粒含有篩選標簽：strep，賦予LBA4404菌株鏈霉素抗性，適用于菸草、番茄、煙草等植物的轉基因操作。LBA4404電轉感受態特別適用于大質粒的轉化：經pCAMBIA2301質粒(size:11633bp)檢測轉化效率可達104cfu/μg；經pCAMBIA2301-ZH質粒（size:40kd）檢測轉化效率可達103cfu/μg。  

操作方法  

1.0.2cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。  

2.取-80℃保存的農桿菌感受態插入冰中5分鐘，待其融化，加入1-5ug質粒DNA（質粒體積不大于6ul，最好用試劑盒抽提，雙蒸水溶解），用手撥打管底混勻，立即插入冰中，用200ul槍頭將感受態-質�；旌衔锟焖僖频诫姄舯�中，蓋上杯蓋，空管保留待用。  

3.啟動電轉儀，設置參數：C=25uF，PC=200ohm，V=2400V（此參數為Biorad推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700ul無抗生素的LB并轉移到感受態空管中，28℃振蕩培養2~3小時。  

4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天（當平板只含有50ug/mlkan時，28℃培養48h即可；平板中同時加入50ug/mlkan，20ug/mlrif時，需28℃培養60h；如果使用的平板含有50ug/mlrif則需要28℃培養72-90h）。  

注意事項  

1.感受態細胞最好在冰上融化。  

2.混入質粒時應輕柔操作。  

3.轉化高濃度的質�？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。